研究背景:宫颈癌是严重危害妇女健康的常见恶性肿瘤之一,是第四大女性癌症相关死亡病因。每年全球约有60多万的新发病例,30多万的死亡病例。虽然有效的筛查可提高宫颈癌的早期诊断率、多学科相结合的综合治疗也在发展和完善,但处于中晚期的宫颈癌患者预后仍较差,5年生存率不足50%。因此探索宫颈癌发生、发展的潜在分子机制,寻找有效的肿瘤标志物和治疗靶点对于实现早诊断、早治疗以及延缓或避免宫颈癌的复发至关重要。C2结构域是一个长度约为130个残基的Ca~(2+)结合结构域,存在于多种真核蛋白中。现已有研究表明,具有C2结构域的蛋白可在蛋白相互作用、细胞信号传导和肿瘤发生发展等多个生物过程中发挥重要作用。例如,具有C2结构域的NEDD4L蛋白在卵巢癌中表达下调,并可调节卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移;具有C2结构域的Smurf蛋白可直接与PIPKIγ的激酶结构域相互作用,进而调控肺癌细胞的增殖、迁移。TC2N是一种具有C2结构域的蛋白,属于羧基末端型串联C2蛋白家族,其结构特征提示该蛋白可能在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。目前TC2N基因Tezacaftor分子式对于肺癌及乳腺癌的作用及分子机制已有文章报道,我们拟进一步探索TC2N基因对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响,阐明TC2N基因在宫颈癌增殖、凋亡中的作用机制,为发现宫颈癌新的癌基因、寻找新的有效治疗靶点提供理论依据。方法:1宫颈癌组织和正常宫颈组织中TC2N表达的检测。通过TCGA和Oncomine数据库分析TC2N m RNA在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的表达情况。通过实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)实验、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)实验、免疫组化实验对人宫颈癌标本和配对癌旁正常宫颈标本中TC2N m RNA和蛋白质表达情况进行进一步分析。2宫颈癌细胞(HeLa、Si Ha)及正常宫颈上皮细胞(HUCEC)中TC2N基因的m RNA和蛋白质表达的检测。通过q RT-PCR及蛋白免疫印迹实验检测宫颈癌细胞(HeLa、Si Ha)及正常宫颈上皮细胞(HUCEC)中TC2N m RNA及蛋白质的表达差异。3 TC2N的蛋白质表达水平与宫颈癌患者的临床病理特征、生存期相关性分析。通过89例宫颈癌组织标本分析TC2N基因的蛋白质表达水平与患者绝经前/后、HPV感染、分化程度、病理类型、浸润深度、肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移、脉管转移有无相关性。进一步,通过Kaplan-Meier方法分析TC2N蛋白表达水平与宫颈癌患者生存期之间的关系。4检测TC2N基因对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响。采用CCK-8实验、克隆形成实验以及细胞凋亡实验分析TC2N基因差异表达对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响。采用裸鼠成瘤实验分析TC2N基因差异表达对宫颈癌在体内生长情况的影响。5 TC2N基因在宫颈癌中调控增殖、凋亡的机制研究。通过高通量测序技术分析TC2N基因调控宫颈癌细胞增殖、凋亡的下游信号通路,并通过蛋白免疫印迹实验检测TC2N基因在宫颈癌细胞和裸鼠皮下移植瘤中对下游通路相关蛋白表达的影响。应用通路抑制剂后,通过蛋白免疫印迹实验、CCK-8实验、克隆形成实验及细胞凋亡实验进一步验证TC2N基因是否参与调控下游通路,从而影响宫颈癌细胞增殖、凋亡。结果:1 TC2N在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织。通过分析TCGA数据库和Oncomine数据库中的宫颈癌数据,评估TC2N m RNA在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达,发现宫颈癌组织中TC2N m RNA的表达明显高于正常宫颈组织(P<0.05)。之后进一步分析了89个宫颈癌标本及89个匹配的癌旁正常宫颈标本中TC2N m RNA和蛋白质的表达,结果表明与正常宫颈组织相比,TC2N m RNA和蛋白质的表达在宫颈癌组织中明显上调(P<0.01)。2宫颈癌细胞(HeLa、Si Ha)中TC2N m RNA和蛋白质的表达显著高于正常宫颈上皮细胞(HUCEC)。通过q RT-PCR实验及蛋白免疫印迹实验检测宫颈癌细胞(HeLa、Si Ha)及宫颈上皮细胞(HUCEC)中TC2N m RNA及蛋白质的表达,发现宫颈癌细胞(HeLa、Si Ha)中TC2N m RNA和蛋白质的表达明显高于宫颈上皮细胞(HUCEC)(P<0.01)。3 TC2N蛋白表达与宫颈癌患者的肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移呈正相关,与宫颈癌患者的生存期呈负相关。通过分析89例宫颈癌患者的TC2N蛋白表达与宫颈癌患者的临床病理特征,发现TC2N蛋白表达与宫颈癌患者的肿瘤直径(P<0.01),FIGO分期(P<0.05)以及淋巴结转移(P<0.05)呈正相关。通过Kaplan-Meier方法分析宫颈癌患者生存期与TC2N蛋白表达之间的关系,发现TC2N蛋白表达水平与宫颈癌患者的生存期呈负相关(P<0.05)。4干扰TC2N基因表达可抑制宫颈癌细胞增殖,促进宫颈癌细胞凋亡。通过CCK-8实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验分析TC2N基因差异表达对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响,发现敲减TC2N基因抑制了宫颈癌细胞的增殖(P<0.01)、克隆形成(P<0.01),并增加了宫颈癌细胞凋亡(P<0.01)。采用裸鼠成瘤实验分析TC2N基因差异表达对宫颈癌在体内生长情况的影响,发现敲减TC2N基因抑制了裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01)。提示TC2N基因可能是一个待定的癌基因。5 TC2N基因通过激活MAPK/ERK通路促进宫颈癌细胞增殖,抑制宫颈癌细胞凋亡。通过高通量测序技术对TC2N基因差异表达的宫颈癌细胞进行分析,发现574个差异表达基因,并且差异表达基因在MAPK通路中明显富集。为确定TC2N基因是否参与MAPK信号通路的调控,在体外宫颈癌细胞及体内裸鼠皮下移植瘤中差异表达TC2N基因后通过蛋白免疫印迹实验检测MAPK/ERK通路相关靶基因的蛋白质表达,结果表明敲减TC2N基因可显著抑制MAPK/ERK通路experimental autoimmune myocarditis活性,通路相关靶基因Raf、p-ERK、c-Fos及c-Myc的蛋白质表达明显下调。进一步在过表达TC2N基因的宫颈癌细胞中应用MAPK通路抑制剂U0126,发现应用通路抑制剂后宫颈癌细胞的增殖能力显著下降(P<0.01),细胞凋亡明显增多(P<0.01),逆转了TC2N基因对宫颈癌细胞增殖及凋亡能力的影响,进一步验证了TC2N基因在宫颈癌中参与调控了MAPK/ERK信号AZD1152-HQPA半抑制浓度通路。结论:1 TC2N基因是宫颈癌新的癌基因,其在宫颈癌中高表达,并与患者的肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移呈正相关,与宫颈癌患者的生存期呈负相关。2 TC2N基因可促进宫颈癌细胞增殖,抑制宫颈癌细胞凋亡。3 TC2N基因通过激活MAPK/ERK信号通路促进宫颈癌细胞增殖,抑制宫颈癌细胞凋亡。